Recherche de procédés thérapeutiques


Depuis de 1996, l’UETM est impliquée dans la mise au point d’essais thérapeutiques. Différentes approches sont considérées et la majorité d’entre elles font appel au modèle GRMD pour lequel des outils spécifiques d’évaluation ont été développés par l’équipe.

Greffe de mésoangioblastes
Coordinatrice de projet: Ane Uriarte

Les mésoangioblastes sont des cellules souches adultes associées aux vaisseaux sanguins, capables de se différencier en cellules de la lignée mésodermique, et notamment en cellules de muscle squelettique. Ces cellules présentent l’intérêt de franchir les endothéliums vasculaires des premiers capillaires qu’elles rencontrent et d’être attirées par les contextes inflammatoires, fréquents dans les processus myopathiques. La capacité des mésoangioblastes à rejoindre le muscle depuis le compartiment vasculaire a été démontré in vivo chez des souris dystrophiques (Sampaolesi et al., 2003).

En collaboration avec le groupe de Giulio Cossu du Stem Cell Research Institute de Milan, nous avons montré, chez les chiens GRMD, que la greffe de mésoangioblastes restaure à des niveaux très satisfaisants l’expression de la Dystrophine manquante dans de nombreux groupes musculaires et qu’un bénéfice fonctionnel y est associé (Sampaolesi et al., Nature 2006).

Extrait de Sampaolesi et al., Nature 2006

(A-C') Marquage Azan Mallory sur coupes transversales de biopsies musculaires effectuées chez un chien traité par greffe hétérologue (mésoangioblastes venant d'un donneur sain) (A,A'), chez un chien traité par greffe autologue (mésoangioblastes venant du chien malade lui-même et corrigés génétiquement) (B,B'), et chez un  chien non traité (C, C').
(A", B") Immunomarquage anti-Dystrophine (rouge) et marquage DAPI (bleu) de coupes transversales de biopsies musculaires montrant la restauration de l'expression de la dystrophine chez les chiens traités.

Ces résultats prometteurs donnent un nouvel élan à la recherche en matière de thérapie cellulaire. Cependant, un point reste à éclaircir. Chez les chiens GRMD traités, nous avons observé que l’expression de la dystrophine variait d'un muscle à l'autre et au sein d'un même muscle, suggérant que les mésoangioblastes aient une distribution et/ou une capacité de colonisation des muscles non homogène. Pour comprendre cette variabilité, et surtout d’optimiser la stratégie, nous avons démarré une étude non invasive consistant à suivre le devenir de mésoangioblastes radio-marqués après leur injection chez le chien. Ces examens sont réalisés dans le centre anticancéreux vétérinaire de l’EVNA, en collaboration avec l’équipe du Dr Patrick Devauchelle.

Saut d’exon thérapeutique
Coordinatrice de projet: Inès Barthélémy 

Chez les chiens GRMD, le gène codant pour la Dystrophine porte une  mutation au niveau du site accepteur d’épissage de l’intron 6. Il en résulte soit la rétention de l’intron 6 (A), soit la perte de l’exon 7 (B) soit occasionnellement la perte des exons 7 et 8 (C). Ces trois formes d’ARNm entrainent un décalage du cadre de lecture traductionnel et en conséquence la production d’une protéine tronquée non fonctionnelle.

Le saut d’exon thérapeutique est une stratégie qui consiste à rétablir un cadre de lecture fonctionnel en empêchant l’incorporation d’un ou plusieurs exons lors du processus d’épissage. Pour ce faire des oligonucléotides antisens sont utilisés pour masquer des régions nécessaires à l'épissage. Dans le cas particulier de la dystrophine canine, l’excision des exons 6 à 8 du transcrit restaure un cadre de lecture opérationnel. 

Adapter à partir des illustrations de Luis Garcia (Institut de Myologie)

En collaboration avec le groupe de Luis Garcia de l’Institut de Myologie (Pitié-Salpêtrière), nous évaluons le bénéfice biologique apporté par cette stratégie chez le chien GRMD. Le saut d’exon est induit à l’aide d’oligonucleotides anti-sens complémentaires des sites d’épissage exoniques (ESE) des exons 6 et 8. Afin de protéger les oligonucleotides des processus de dégradation cellulaire, ils ont été associés à de petits ARNs nucléaires (U7snRNAs). Les constructions sont vectorisés dans des AAV (Adeno-Associated Virus) non réplicatifs produits par  le groupe de Robert Kotin (Laboratoire de Biochimie et de Génétique, National Institutes of Health, USA). Après injection intramusculaire de la construction vectorisée, nous avons observé l'expression d'une dystrophine tronquée mais encore fonctionnelle, dite « quasi-dystrophine ».

 
Expression de la Dystrophine visualisée par immunomarquage fluorescent sur des sections transversales de biopsies de biceps fémoral de chien sain, de chien GRMD et de chien GRMD traité (trois mois après injection intramusculaire de 3.5x10¹² vg d'AAV2/1-U7-ESE6/U7-ESE8)
 

Nos résultats démontrent pour la première fois qu’il est possible d’induire un saut multi-exonique, et ce chez un animal de grande taille. Une telle stratégie, appliquée aux êtres humains, permettrait d’augmenter de manière considérable le nombre de patients susceptibles d’être traités par saut d’exon thérapeutique. Nos résultats apportent aujourd’hui une preuve de principe, cependant, avant d’envisager des essais cliniques humains, il nous faut développer une méthode d’administration systémique.